營養期殺蟲蛋白(vegetative insecticidal proteins, Vips)是由蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringi? ensis, Bt)營養生長期分泌的一種殺蟲蛋白?最早由 Estruch等(1996)從蘇云金芽胞桿菌AB88菌株離心 的上清液中發現?Vip3A 蛋白對鱗翅目昆蟲具有 廣譜的殺蟲活性,與任何已知的殺蟲晶體蛋白均沒 有同源性;隨著害蟲對殺蟲晶體蛋白抗性的產生, Vip 蛋白成為一個極為豐富且潛力巨大的資源 (Beard et al., 2008; Ramasamy et al., 2008; Yu et al., 2012)。

關于Vip蛋白結構與功能的研究,迄今主要集 中在Vip3Aa (Song et al., 2016)?但是,與目前研究 比較深入的殺蟲晶體蛋白相比,關于 Vip3 蛋白的 結構?功能及作用模式等方面的報道較少,并且未 得出一致的結論(Chakroun et al., 2016)?部分研究 表明,絲氨酸突變對Vip3Aa殺蟲活性影響較大,例 如,Vip3Aa11氨基端的第9位絲氨酸突變為天冬酰 胺(S9N)?第193位絲氨酸突變為蘇氨酸(S193T)后, 對甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)和棉鈴蟲(Heliothis armigera)的殺蟲活性有明顯提高(Liu et al., 2017)? Dong 等(2012)將 Vip3Aa7 中的半胱氨酸突變為絲 氨酸,獲得的突變體(C292S, C507S, C401S)對小菜 蛾(Plutella xylostella)殺蟲活性明顯降低,甚至喪失 活性?Chi等(2017)將Vip3Aa的543位絲氨酸突變 為天冬酰胺(S543N)?686 位絲氨酸突變為精氨酸 (S686R),獲得的突變體對甜菜夜蛾殺蟲活性分別 提高5倍和8.98倍。

雖然前人已經對Vip3Aa11的結構與功能關系 進行了一些探索,但要完全闡明 Vip3Aa11 的殺蟲 機理尚需更廣泛的研究?本課題組比對Vip3Aa11 與Vip3Aa39氨基酸序列的差異,選定3個位于活性 中心區?可能參與絲氨酸突變的位點進行定點突變，利用甜菜夜蛾和棉鈴蟲進行殺蟲活性測定，并 進行胰蛋白酶敏感性及二級結構預測分析，旨在探 尋影響殺蟲活性的氨基酸位點及其殺蟲活性變化 原因，為殺蟲機制研究提供基礎材料。

定點突變所用的質粒pET-vip3Aa11?大腸桿菌 (Escherichia coli) BL21(DE3)和 JM109 菌株均由東 北農業大學生物化學與分子生物學實驗室保存? 2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 和 DpnⅠ (DMT)酶購自 TransGen Biotech (北京);質粒提取 試劑盒?DNA凝膠回收試劑盒購自Axygen (美國); PageRuler Prestained Protein Ladder 購 自 Thermo Scientific (美國);Gel Red 核酸染料購自 BIOTIUM (美國)。

根據 vip3Aa11 基因(GenBank No. AAR36859) 全長序列,通過 DNAMan 7.0 設計定點突變引物, 引物設計包含5'端重疊區和3'端延伸區;除突變位 點外,引物長度大約25~30 bp,5'端重疊區包含15~ 20 bp,3'端延伸區包含至少10 bp?突變位點位于2 條引物上,分別位于正向突變引物重疊區下游?緊 鄰重疊區和反向突變引物 5'端?引物由上海生工 生物工程技術服務有限公司合成。

以轉化 E. coli JM109 菌株的 pET-vip3Aa11 質 粒為模板,分別以G200S-F/R?F442S-F/R和S726TF/R為引物(表1),PCR擴增含突變位點的vip3Aa11 基因全長片段?PCR反應體系均為:質粒1 μL,正反向突變引物(10 μmol/L)各 1 μL,2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL,加 ddH2O 至 50 μL? PCR 反應條件均為:94 ℃預變性 2 min;94 ℃變性 20 s,55 ℃退火 20 s,72 ℃延伸 3 min,23 個循環; 72 ℃延伸10 min? 為有效篩選突變克隆,需利用DMT酶體外降 解非突變型質粒模板?因此,將1 μL DMT酶加入 50 μL PCR產物中,混合均勻,于37 ℃孵育1 h?取 5 μL酶消化產物轉化E.coli BL21,挑取單克隆并送 至吉林省庫美生物科技有限公司進行序列測定分 析,以驗證預期突變位點的堿基變化是否正確。

挑取1.3中含預期突變位點的E. coli單菌落于 5 mL 液體 LB 培養基,于 37 ℃?220 r/min 活化過 夜?以 1% 接種量接種于 50 mL LB 液體培養基, 于 37 ℃?220 r/min 培養 2~2.5 h,直至 OD600 約為 0.5?加入終濃度為 1 mmol/L 的異丙基-β-D-硫 代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside, IPTG), 于 150 r/min?16 ℃誘導 12 h;于 4 ℃?8 000 r/min 離心 8 min,收集菌體沉淀 ;以 5 mL 20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)懸浮;經超聲波破碎(參數設置: 功率 70%; 超聲 3 s, 間隙 1 s, 全程 3 min),于 4 ℃? 12 000 r/min離心15 min,收集上清液。

取 Vip3Aa11 及其突變體蛋白樣品加入 5×上 樣緩沖液,混勻并煮沸 8 min,于 12 000 r/min 離心 1 min,取 5 μL 上清液進行 SDS-PAGE,電壓為 120V,分離膠濃度為10%?然后以考馬斯亮藍R250進 行凝膠染色?對于凝膠上的蛋白條帶,使用軟件 QuantityOne 4.5進行定量分析:選取3個已知濃度 的標準牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA) 為蛋白定量標準,選取凝膠空白區為背景(background),選取 Vip3Aa11 及其突變體中 88 kD 的目 的條帶,經軟件處理得到目的蛋白濃度。

在室內殺蟲活性測定中,稱取30 g人工飼料置 于培養皿中,分別與3 mL不同濃度的Vip3Aa11及 其突變體蛋白樣品混合,均勻分裝于24孔板中;其 中,甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的殺蟲活性測定設 置 80?40?20?10?1?0.1 μg/mL 等 6 個濃度,棉鈴蟲 (Heliothis armigera)的殺蟲活性測定設置 200?100? 50?25?5?1 μg/mL等6個濃度?選取健康的?未經 取食的初孵幼蟲(孵化后12 h內, 購自河南省濟源 白云實業有限公司)作供試蟲,用軟毛筆輕移入已 有感染飼料的小孔內;每孔1頭蟲,每個處理重復3 次?以轉化pET28a質粒空載體的菌體總蛋白作為 陰性對照,以未發生突變的 Vip3Aa11 野生型蛋白 作為陽性對照?在每個小孔上方鋪上濕潤衛生紙 后蓋上塑料蓋,以橡皮筋捆緊,豎立放入30 ℃ (棉 鈴蟲)或25 ℃ (甜菜夜蛾)光照培養箱（上海精宏實驗設備有限公司提供）;培養7 d后調 查 活 蟲 數 ,并 觀 察 幼 蟲 生 長 情 況 ,使 用 POLO (1987)軟件計算致死中濃度(median lethal concentration, LC50)?以野生型Vip3Aa11的LC50與其他殺 蟲蛋白LC50的比值作為相對毒力。

1.7 胰蛋白酶敏感性分析

按照1.4步驟提取Vip3AA11及其突變體蛋白， 以 PBS 溶液(pH 8.0)代替 20 mmol/L Tris-HCl。將 蛋白樣品與1 mg/mL胰蛋白酶按照10∶1的比例混 合均勻，于37 ℃水浴中分別放置2和32 min，加入 5×蛋白上樣緩沖液終止反應，然后進行SDS-PAGE 分析。

以pET-vip3Aa11質粒為模板,利用含突變位點 的引物進行 PCR 擴增?PCR 產物經 DMT 酶消化 后,取5 μL轉化E. coli BL21感受態細胞,獲得的單 克隆菌落用vip3AF/R引物對進行PCR鑒定?結果 顯 示 ,Vip3Aa11 及 其 3 個 突 變 體 G200S?F442S? S726T均能擴增出預期的2 370 bp目的條帶(圖1), 說明陽性單克隆菌落中含有vip3Aa11 基因或突變 基因?對于每個定點突變樣品，選取2個經PCR鑒定 正確的單克隆進行測序。對測序結果進行序列分 析，均實現預期的點突變。

蘇云金芽胞桿菌營養期殺蟲蛋白Vip3Aa對多 種鱗翅目害蟲具有較好的殺蟲活性,并且被證實與 目前應用較多的殺蟲晶體蛋白無交互抗性,具有廣 闊的應用前景?Vip3Aa 類蛋白是被發現?研究報 道 最 多 的 一 類 Vip 蛋 白 ,并 且 Vip3Aa19 與 Vip3Aa20 已經成功的應用于轉基因作物中(Yu et al., 1997; Yu et al., 2001)。