阿爾茨海默?。ǎ粒欤瑁澹椋恚澹?rsquo;ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）又稱遺忘型癡呆癥，是一種神經系統退行性疾病，嚴重影響患 者的認知、記憶以及社會生活能力 ．ＡＤ的發病機制一直是研究者密切關注的問題，其中主要涉及膽堿能 功能障礙、Ａβ淀粉樣蛋 白、氧化應激及自由基損傷等 ．目 前 臨 床 治 療 ＡＤ 主 要 采 用 以 乙 酰 膽 堿 酯 酶 （ＡＣｈＥ）為藥物靶點的乙酰膽堿酯酶抑制劑（ＡＣｈＥｌｓ）；另有研究指出，氧化應激可能會增加自由基的水平， 從而導致 Ａβ淀粉樣蛋白升高，因此清除細胞內過剩的自由基或成為治療 ＡＤ的新方向．

在日照海域采集野生牡蠣，通過分離純化得到共生細菌．

（ｇ／１００ｍＬ）．ＬＢ液體培養基：胰蛋白胨１ｇ，酵母浸粉０．５ｇ，過濾滅菌海水１００ｍＬ，ＰＨ 自 然；ＬＢ固體培養基：ＬＢ液體培養基 ＋１．６ ％ 瓊脂粉．

恒溫振蕩培養箱（上海一恒科學儀器有限公司），恒溫生化培養箱（上海精宏實驗設備有限公司），ＰＣＲ儀（美國ＢＩＯ－ＲＡＤ），多功能檢測儀（美國Ｂｉｏｔｅｋ公司），旋轉蒸發儀（上海亞榮儀器有限 公司）；細菌基因組 ＤＮＡ 提取試劑盒、ＰＣＲ擴增等試劑均購自天根生化科技有限公司，碘代硫代乙酰膽堿（ＡＴＣＩ）、乙酰膽堿酯酶（ＡＣｈＥ）及 ＤＴＮＢ，１，１－ 二苯基 －２－ 三硝基苯肼（１－ｄｉｐｈｅｎｙｌ－２－ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ，ＤＰＰＨ） 等試劑均購自上海源葉生物科技有限公司．

將新鮮野生牡蠣于７５％ 酒精中浸泡３０－６０ｓ，無菌海水潤洗３次，稱?。保?ｇ牡蠣肉于１００ｍＬ滅菌海水中浸泡，１６０ｒ獉ｍｉｎ－１ 振蕩４５ｍｉｎ，勻漿，過濾得牡蠣菌懸液．無菌條件下從菌懸 液中吸?。保?mu;Ｌ至三角瓶中，滅菌海水補足至５００ｍＬ，得到１０－１ 的菌液，然后梯度稀釋分別得到１０－２、１０－３、 １０－４、１０－５、１０－６、１０－７、１０－８、１０－９ 菌液．吸取１００μＬ上述各濃度菌液均勻涂布于ＬＢ固體培養基上，置于３７℃ 恒溫培養箱中，定期觀察，分離純化得到單一菌落．

參照文獻提取已分離純化菌株的ＤＮＡ，以２７Ｆ／１４９２Ｒ為引物進行ＰＣＲ擴 增，ＰＣＲ反應條件為：預變性９５℃３ｍｉｎ→ 變性９５℃４５ｓ→ 退火５５℃４５ｓ→ 延伸７２℃５０ｓ→ 充分延伸 ７２℃１０ｍｉｎ→ 保存１６℃２ｍｉｎ→ 循環擴增３５次，取５μＬＰＣＲ產物進行瓊脂糖凝膠電泳，其余送蘇州金 唯智生物科技有限公司測序．

將分離出的菌株接種至 ＬＢ液體培養基中，恒溫振蕩培養 （３６ｈ，３７ ℃，１６０ｒ獉ｍｉｎ－１）．離心發酵液（６５００ｒ獉ｍｉｎ－１，２５ｍｉｎ）取上清，２倍體積乙酸乙酯萃?。炒?，合并 乙酸乙酯層，濃縮得粗浸膏，將上述粗浸膏溶于 ＤＭＳＯ，配置成５ｍｇ·ｍＬ－１ 溶液備用．

參照文獻采用改良 Ｅｌｌｍａｎ法測定其對 ＡＣｈＥ 的抑制活性．磷酸緩沖溶液（０．１ ｍｏｌ獉Ｌ－１，ＰＨ＝８．０），ＡＣｈＥ（０．０５Ｕ獉ｍＬ－１），ＤＴＮＢ（０．０６６７ｍｏｌ獉Ｌ－１），ＡＴＣＩ（０．１ｍｍｏｌ獉Ｌ－１）．?。粗В?ｍＬＥＰ管，設置空白（Ａ１）、標準（Ａ２），樣品本底（Ａ３），樣品（Ａ４）組．分別加入磷酸緩沖溶液２９５０μＬ、２８８０ μＬ、２９５０μＬ和２８８０μＬ；Ａ１ 和Ａ２ 組中分別加入ＤＭＳＯ１００μＬ；Ａ３ 和Ａ４ 組中加入１００μＬ的待測樣品溶液； Ａ２ 和Ａ４ 組加入７０μＬ的ＡＣｈＥ溶液．充分混勻，冷藏２０ｍｉｎ后，分別加入１００μＬ的ＤＮＴＢ和２０μＬ的ＡＴＣＩ 溶液，得到最終的反應體系．３７ ℃ 水浴反應２５ｍｉｎ后，加終止劑０．４％ ＳＤＳ（１００μＬ）．本實驗以鹽酸他克林 （Ｃｏｇｎｅｘ）作為陽性對照．在４１２ｎｍ 處測得 ＯＤ值，按公式計算出抑制率 抑制率（％）＝ （Ａ２ －Ａ１）－ （Ａ４ －Ａ３） Ａ２ －Ａ１ ×１００％．

參照文獻方法，采用ＤＰＰＨ自由基清除法測定牡蠣內生細菌次級代謝產物的 抗 氧化活性．以７５％ 乙醇作為參比溶液調零，空白組（Ａ０）中加入７５％ 乙醇１００μＬ，ＤＰＰＨ 溶液（０．４ｍｍｏｌ ·Ｌ－１）１００μＬ；樣品組（Ａｉ）中加入待測樣品２μＬ，７５％ 乙醇９８μＬ，ＤＰＰＨ 溶液１００μＬ；樣品本底組（Ａ１）中 加入待測樣品２μＬ，７５％ 乙醇１９８μＬ，以抗壞血酸（Ｖｃ）為陽性對照．室溫暗置３０ｍｉｎ后，在最大波長為５１７ ｎｍ 測 ＯＤ值，按照公式計算清除率 清除率（％）＝ Ａ０ － （Ａｉ －Ａ１） Ａ０ ×１００％．

菌株部分生理生化等特性參照《常見細菌系統鑒定手冊》 進行．

通過對牡蠣共生細菌進行分離純化、培養，共得到并鑒定出牡蠣共生細菌６２株．采用通用引物２７Ｆ和 １４９２Ｒ進 行 ＰＣＲ 擴 增，經 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳，基 因 測 序 結 果 經 Ｂｌａｓｔｎ 比 對，結 果 表 明，ＨＹＭＬ－１－６、 ＨＹＭＬ－１－２５、ＨＹＭＬ－１－３４ 和 ＨＹＭＬ－１－４４ 菌 株 為 孤 菌 屬；ＨＹＭＬ－１－１１、ＨＹＭＬ－１－２２、ＨＹＭＬ－１－２７、 ＨＹＭＬ－１－３７、ＨＹＭＬ－１－３８ 和 ＨＹＭＬ－１－４０ 菌 株 為 芽 孢 桿 菌 屬；ＨＹＭＬ－１－４、ＨＹＭＬ－１－１２、ＨＹＭＬ－１－１９、 ＨＹＭＬ－１－３１菌株為運動魯杰 氏 菌；ＨＹＭＬ－１－１５、ＨＹＭＬ－１－１６、ＨＹＭＬ－１－４６ 菌 株 為 黃 桿 菌；ＨＹＭＬ－１－１４、 ＨＹＭＬ－１－２０、ＨＹＭＬ－１－５２菌株為交替單胞菌；ＨＹＭＬ－１－４７菌株為嗜熱脂肪芽孢桿菌；其余４１株菌株為交 替假單胞菌屬，因此，假單胞菌屬為牡蠣共生細菌中優勢菌屬．部分菌株１６ＳｒＲＮＡ 基因序列比對分析結果 如表１所示．

ＡＣｈＥ活性篩選 對牡蠣內生細菌的次級代謝產物進行抑制 ＡＣｈＥ活性篩選，結果如圖１所示，有１３株細菌的次級代謝產物 粗提物（５μｇ·ｍＬ－１）對 ＡＣｈＥ具有一定的抑制活性，分別為 ＨＹＭＬ－１－３，ＨＹＭＬ－１－６，ＨＹＭＬ－１－９，ＨＹＭＬ－１－１０， ＨＹＭＬ－１－１１，ＨＹＭＬ－１－１２，ＨＹＭＬ－１－１８，ＨＹＭＬ－１－２４，ＨＹＭＬ－１－２６，ＨＹＭＬ－１－２７，ＨＹＭＬ－１－３９，ＨＹＭＬ－１－４７， ＨＹＭＬ－１－６２．其中，ＨＹＭＬ－１－１１和 ＨＹＭＬ－１－６２菌株次級代謝產物的活性較強，抑制ＡＣｈＥ活性ＩＣ５０ 分別為５．０１和４．５３μｇ·ｍＬ－１． 

海洋資源因其特殊的環境，在長期的進化過程中產生一系列獨特的次級代謝產物，這些次級代謝產物具有化學結構新穎和生物活性多樣的特點，因此海洋資源是產生新型生物活性物質的寶庫 ．研究表明，從 海綿、藻類和海鞘等分離出的海洋細菌Ｓ．ｔｒｏｐｉｃａ、Ｓ．ａｒｅｎｉｃｏｌａ、Ｓ．ｐａｃｉｆｉｃａ 等，其次級代謝具有抗癌、 抗菌、抗炎、抗瘧等作用，其中一些已應用于臨床，如環孢菌素Ａ、利福霉素、環馬林素Ｄ等 ．此外，海洋微 生物中芽孢桿菌屬的成員其次生代謝產物表現出多種獨特的結構和生物活性 ．王鳳舞等從青島海域牡 蠣中分離得到８株內生細菌，然而僅一株細菌的次級代謝產物具有乙酰膽堿脂酶抑制活性，本研究從日照海 域野生牡蠣中分離純化得到６２株內生細菌，對其進行分子生物學鑒定，結果顯示，其中４株為孤菌屬，６株為 芽孢桿菌屬，４株為魯杰式菌屬，３株為黃桿菌屬，３株為交替單胞菌屬，１株為嗜熱脂肪芽孢桿菌，其余４１株 為交替假單胞菌屬，因此，交替假單胞菌屬為牡蠣內生細菌中優勢菌屬．抑制 ＡＣｈＥ 活性和抗氧化活性研究 結果表明，１３株菌株具有一定的抑制 ＡＣｈＥ活性；２２株菌株顯示較強的ＤＰＰＨ 自由基的清除作用．此外還發 現，具有 ＡＣｈＥ抑制作用的１３株菌株的次級代謝產物均顯示較強的抗氧化活性，揭示其次級代謝產物中含 有潛在的活性物質，有望為治療以膽堿能缺乏及自由基過剩為特征疾病的先導化合物的開發提供一定的理 論依據。