關節(jié)軟骨中軟骨細胞少，不能充分填充缺損 區(qū)，并且無血管結構，無神經組織，無論是急性、慢 性還是退化性疾病引起的軟骨缺損，損傷后自我修 復能力差。傳統(tǒng)的軟骨修復方法，有微骨折手術、 骨軟骨移植術、骨膜移植術等，存在供源不足、疾 病傳播、免疫排斥等問題。組織工程的發(fā)展可解決 以上問題。本研究對α-1，3-半乳糖苷轉移酶基因敲 除豬肋軟骨脫細胞處理，獲得低免疫原性細胞外基 質，與聚合物甲基丙烯酰化明膠（GelMA）溶液按不 同比例均勻混合，紫外交聯(lián)制備復合材料支架，用 于軟骨個性化修復。

α-1，3-半乳糖苷轉移酶 基因敲除豬（南京華貞生物醫(yī)藥科技有限公司）； GelMA（溫州優(yōu)墨生物科技有限公司）；骨髓間充 質干細胞（美國ATCC）；Tris-HCl、十二烷基硫酸鈉 （SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、4%組織細胞固定液、 中性樹脂、Masson三色染色液（北京索萊寶生物科 技有限公司）；Aprotinin、Leupeptin（德國Roche 公司）；PMSF（美國Sigma公司）；胎牛血清、低糖 DMEM、0.25%胰酶（美國Gibco公司）；DNeasy Blood & Tissue Kit（德國QIAGEN公司）；胰蛋白酶（美國 Biosharp公司）；蘇木素伊紅染色液、青霉素鏈霉 素、DAPI（上海碧云天生物技術有限公司）；CCK-8 試劑盒（日本同仁公司）；Live/Dead試劑盒（美國 Thermo公司）；羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽（上海翊圣 生物科技公司）。

冰凍切片機、NanoDrop（美國 Thermo公司）；掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM，日本Hitachi公司）；冷凍研磨儀（德 國Retsch公司）；正置熒光顯微鏡（日本Nikon公 司）；DHR流變儀（美國TA公司）；低溫離心機（德國 Eppendorf公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；全波長微孔讀板機（美國BioTek 精宏公司）；真空冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀 器有限公司）；精密分析型電子天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司）。

取新鮮基因敲除豬軟骨 去除軟組織及骨膜，切成約1.5 cm×0.5 cm×0.2 cm 的塊狀軟骨，聯(lián)合應用胰蛋白酶、去污劑、核酸酶、蛋白酶抑制劑對塊狀軟骨進行脫細胞處理。具體脫 細胞流程如下（每進行下一步前均用超純水清洗軟 骨）：

①將塊狀軟骨放入Tris-HCl溶液（10 mmol/L， pH 8.0）中孵化 24 h，控制溫度于 45 ℃；

②在 0.25%的胰蛋白酶溶液中消化24 h，保持溫度37 ℃， 作用24 h；

③放入含 0.1% SDS的Tris-HCl溶液 （10 mmol/L，pH 8.0）中24 h，恒溫45 ℃；

④用 含0.1% EDTA的 PBS緩沖液，配制蛋白酶抑制劑 （PMSF 1 mmol/L、leupeptin 1 μg/mL、aprotinin 10 kIU/mL），放入該溶液中清洗2次，每次30 min， 恒溫37 ℃；

⑤再次放入含0.1% SDS的Tris-HCl溶 液（10 mmol/L，pH 8.0）中，恒溫45 ℃，孵化24 h；

⑥在50 mmol/L，pH 7.5的Tris-HCl溶液中，配制 氯化鎂10 mmol/L、牛血清白蛋白50 μg/mL、DNA酶 50 U/mL和RNA酶1 U/mL，置于該溶液中作用3 h， 恒溫37 ℃；

⑦在含有0.1% EDTA、蛋白酶抑制劑的 PBS緩沖液中，清洗2次，每次30 min，恒溫37 ℃；

⑧PBS緩沖液反復多次清洗，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/span>

將脫細胞軟骨骨塊 放在冷凍干燥機中凍干3 h，隨后用冷凍研磨儀研 磨成骨粉。設置研磨頻率為20 r/s，時間為15 min， 循環(huán)2次。過篩選取粒徑＜100 μm的骨粉，-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/span>

①DAPI染色檢測脫細胞 效果：將天然軟骨、脫細胞塊狀軟骨用冰凍切片機 切成厚度為5 μm的切片，做好標記，在切片上滴加 DAPI工作液，避光，室溫孵育15 min，PBS漂洗3次， 每次5 min，封片后熒光顯微鏡下觀察。

②軟骨DNA 含量檢測：稱取天然骨粉、脫細胞骨粉各20 mg，裝 入1.5 mL EP管中做好標記，取出DNeasy Blood & Tissue Kit，分別在EP管中加入 180 μL Buffer ATL，20 μL蛋白激酶K，混勻，在56 ℃下孵育2 h 直到組織裂解，在孵育過程中要間斷振蕩；加入 200 μL Buffer AL，混勻；加入200 μL無水乙醇， 混勻；將上述混合物移至 2 mL EP管中的DNeasy Mini濾柱中，6 000×g離心1 min后，棄去濾液、EP管； 將濾柱放入新的2 mL收集管中，加入500 μL Buffer AW1，6 000×g離心1 min后，再棄去濾液、收 集管；將濾柱放入新的2 mL收集管中，加入500 μL Buffer AW2，2 000×g離心3 min后，棄去濾液、收 集管；將濾柱移至新的1.5 mL EP管中，200 μL Buffer AE加到濾柱膜中央洗提DNA，室溫下孵育 1 min，6 000×g離心1 min，重復1次；用Nanodrop檢測DNA純度、濃度，每個樣品重復3遍，取平均值。

③PCR檢測β-actin基因的表達：β-actin引物序列： 上游5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，下游5’-CTCCTTA ATGTCACGCACGAT-3’，反應條件為94 ℃ 3 min，30 個循環(huán)94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸 30 s， 最后72 ℃ 5 min，4 ℃保存。反應結束后用2%瓊 脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察，拍照，分析。

HE 染色檢測細胞外基質結構，步驟如下：將天然軟骨、 脫細胞塊狀軟骨用冰凍切片機切成厚度為5 μm的切 片，蘇木素染色液染色10 min，自來水沖凈多余的 染液，蒸餾水洗滌5 s后，伊紅染色液染色3 min， 洗凈多余染液，甘油封片，于顯微鏡下觀察拍照。 Masson三色染色檢測細胞外基質中膠原纖維成分， 步驟如下：取天然軟骨與脫細胞軟骨切片，用配制 好的Weigert鐵蘇木素染色液染色7 min；酸性乙醇 分化液分化10 s，水洗；藍化液返藍5 min；蒸餾 水洗1 min；麗春紅品紅染色液染色2 min；按蒸餾 水：弱酸溶液按2:1比例配置，用弱酸工作液洗滌 1 min；磷鉬酸溶液洗1 min；弱酸工作液洗1 min； 再直接放入苯胺藍染色液中2 min；弱酸工作液洗1 min；最后封片，光學顯微鏡下觀察。

收集脫細胞軟骨骨粉，冷凍干燥 過夜，用導電膠帶將樣品粘在銅片座上，對樣品噴 金處理后，用SEM觀察骨粉形態(tài)。

以脫 細胞軟骨粉、10% GelMA（取代度75%）前體為原料， 按不同比例（0:100、20:80、35:65、45:55、50:50） 均勻混合，加入 0.5%（w/v）光引發(fā)劑[2-羥基-4’- （2-羥乙氧基）-2-甲基苯丙酮]，在聚四氟乙烯模具 上用光強為18 mW/cm2 ，波長為365 nm的紫外光交 聯(lián)制備脫細胞軟骨/GelMA復合支架（厚1 mm，直徑 8 mm）。

①溶脹性能檢測：將復 合支架放入37 ℃ PBS中，分別在5 min、10 min、 20 min、30 min、1 h、2 h、4 h稱重，稱重前用濾 紙將表面溶液吸干，記支架質量為Wt。達溶脹平衡 的支架放入冷凍干燥機中凍干24 h，稱重記質量為 W0。按下述公式計算支架質量溶脹P（w），重復3次， P（w）=Wt/W0。

②儲能模量檢測：用DHR流變儀8 mm 的平行板夾具，設置1%的形變，37 ℃下，在0.1～ 10 Hz范圍內進行振蕩頻率掃描測試，測不同骨粉 含量支架的儲能模量，每組3個重復樣品。

首先進行骨粉滅菌： 將天然軟骨骨粉、脫細胞軟骨骨粉，浸入 75%乙醇 溶液中滅菌24 h，之后離心去上清液，將骨粉放入 冷凍干燥機中干燥過夜。將GelMA溶于PBS緩沖液中， 配制成10% GelMA溶液，在生物安全柜中用0.22 μm 的濾膜對其進行過濾，將過濾的光引發(fā)劑加入其 中，濃度為 0.5%，按上述不同比例均勻混合軟骨 骨粉和 GelMA溶液，在 96 孔板中制備復合材料支 架。在每個含有支架的孔板上，接種 5 000個人骨 髓間充質干細胞，在 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中用低 糖DMEM+10%胎牛血清+1%青霉素鏈霉素培養(yǎng)基培養(yǎng) 5 d，培養(yǎng)基每3 d更換1次。分別在第1、第3、第5 天用CCK-8細胞增殖毒性檢測試劑盒檢測細胞活性。

使用Live/ Dead試劑盒評估支架上細胞活力。取細胞接種后第 1、第7、第14天樣品評估活力。設置激發(fā)/發(fā)射濾 片488/530 nm觀察活細胞（綠色），530/580 nm觀察 死細胞（紅色）。Live/Dead試劑盒使用步驟：先根 據(jù)說明書配置Live/Dead檢測工作液；吸去樣品中 培養(yǎng)基后加入200 μL Live/Dead檢測工作液，室溫 避光孵育25 min；吸去染液后用無菌PBS清洗3遍， 加入1 mL PBS溶液，熒光顯微鏡下觀察拍照。

取干細胞 接種后第 7、第 14 d的樣品，用 4%多聚甲醛固定， PBS清洗3遍。室溫下用0.1%的Triton處理20 min后， 避光下用羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽（濃度為1:200）標 記細胞骨架15 min，用PBS洗3次，DAPI工作液細胞 核染色15 min。再用PBS清洗3次，加入1 mL PBS后， 用熒光顯微鏡觀察（紅色熒光為細胞骨架染色，藍 色熒光為細胞核染色）。

采用SPSS24.0軟件進行統(tǒng) 計學分析。計量資料以 ±s表示，2組比較采用t檢 驗，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差 異有統(tǒng)計學意義。 2 結果 2.1 脫細胞效果 DAPI染色結果顯示，天然軟骨 組織可見細胞核成分，而脫細胞軟骨組織幾乎無細 胞核成分存在。進一步DNA含量檢測顯示， 天然軟骨DNA含量為161.2 ng/mg，而脫細胞軟骨 DNA含量為15.27 ng/mg，與天然軟骨組織比較差異 有統(tǒng)計學意義。

骨關節(jié)炎以關節(jié)軟骨丟失為特征，與骨肥大和 囊膜增厚有關，表現(xiàn)為關節(jié)疼痛、壓痛、活動受限、 龜裂、滲出、局部炎癥，可發(fā)生在任何關節(jié)，最常見 的是膝、髖關節(jié)和手、腳、脊柱等處的關節(jié)。60歲 以上男性發(fā)病率為9.6%，女性發(fā)病率為18%。在美 國，30%成年人都會受關節(jié)疼痛、腫脹或運動受限的 影響。傳統(tǒng)的軟骨修復方法，有微骨折手術、軟 骨下鉆孔術、骨軟骨移植術、骨膜移植術等。微骨 折術、軟骨下鉆孔術恢復周期長，形成的是無序的 纖維軟骨，在組織學上纖維軟骨與正常透明軟骨不 同，導致療效不佳。自體骨軟骨移植手術簡單， 是一次性手術，但是供源不足，難以維持軟骨細胞表型，不能用于修復超過2 cm2的缺損。同種異 體骨移植可修復較大面積缺損，但會引起免疫排斥 反應，存在疾病傳播風險。組織工程的發(fā)展解決 了軟骨修復的眾多難題，然而異種生物材料植入靈 長類體內后會發(fā)生特有的超急性排斥反應，該排異 反應與異種內皮細胞表面α-1，3-半乳糖基糖蛋白分 子有關。由于靈長類動物沒有該糖分子，因此體內 有大量的α-1，3-半乳糖基糖蛋白分子的抗體存在。 這些抗體迅速激活補體反應，破壞異種組織內皮細 胞而引起超急性排異反應。

本研究采用的α-1，3-半 乳糖苷轉移酶基因敲除豬，具有低免疫原性，對其 肋軟骨脫細胞處理，保留了細胞外基質的同時進一 步降低了免疫原性。盡管脫細胞過程能除去90%細 胞，去除大部分異種抗原，但不能完全清除干凈， 異種組織仍會殘留一小部分抗原，該基因敲除豬能從根源上降低免疫原性，不管在細胞內還是細胞外 基質中都不存在α-1，3-半乳糖基糖蛋白分子，因而 大大降低了異種生物材料移植的風險。美國麻省 總醫(yī)院已成功將基因敲除豬的腎臟、心臟移植到狒 狒，克服了超急性免疫排斥反應。