糞腸球菌為革蘭陽性球 菌，在 外 界 環(huán) 境 中 的 生 存能力非常的強(qiáng)，屬于動(dòng)物腸道內(nèi)正常菌群，可作為 益生菌 用 于 調(diào) 節(jié) 腸 道 的 微 生 態(tài)。 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 部 ２０１７年公布的《允許使用的飼料添加劑品種目錄》 中，腸球菌作為一種飼料級(jí)微生物添加劑被成功收錄。

快速革蘭染液，珠海貝索生物科 技有限公司產(chǎn)品；無 水 乙 醇、二 甲 苯，天 津 永 晟 精 細(xì) 化工有限 公 司 產(chǎn) 品；石 蠟，中國(guó)上海標(biāo)本模型廠產(chǎn) 品；中性樹膠，中國(guó)上海懿洋儀器有限公司產(chǎn)品；２× ｍａｓｔｅｒＰＣＲ Ｍｉｘ、ＤＮＡ ＭａｒｋｅｒＤＬ２０００，東勝創(chuàng)新 生物科技有限公司產(chǎn)品；腦心浸出液肉湯，青島高科 技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限 公 司 產(chǎn) 品；ＰＢＳ磷 酸 鹽 緩沖液，南京森貝伽生物科技有限公司產(chǎn)品。

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石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院傳染 病實(shí)驗(yàn) 室 保 存 的 致 羔 羊 腦 膜 炎 糞 腸 球 菌 （命 名 為 ＸＪ１）。

體重１８ｇ～２２ｇ健康昆明小鼠 （雌雄各半），由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

保存于實(shí)驗(yàn)室的糞腸球菌從 －８０ ℃的低溫冰箱中取出，于冰上溶解。并在超凈 工作臺(tái)中使用接種環(huán)挑取菌液在 ＢＨＩ固體平板培養(yǎng) 基上四區(qū)劃線，倒置于３７℃恒溫培養(yǎng)箱１８ｈ～２４ｈ。

挑取平 板上培養(yǎng)出來的單個(gè)菌落，無 菌 接 入５００ ｍＬ 滅 菌 的裝有 ＢＨＩ液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，置 于３７ ℃搖 床中培養(yǎng)１２ｈ。將 菌 液 無 菌 操 作 分 裝 入５０ｍＬ 的 離心管中，于４ ℃、８０００ｒ／ｍｉｎ離心８ｍｉｎ，收集菌 體并用滅 菌 的 ＰＢＳ沖 洗 菌 體，重 復(fù)２次，最 后 將 所 有菌體收集于１個(gè)５０ｍＬ的離心管中，用４０ｍＬ的 ＰＢＳ緩沖液懸浮，置于４ ℃保存?zhèn)溆谩?/span>

準(zhǔn)備８?jìng)€(gè)無菌的１．５ｍＬ 的 ＥＰ管，編號(hào)１～８，分別加入０．９ｍＬ滅菌的 ＰＢＳ 緩沖液，將 ＰＢＳ懸 浮 的 菌 液 充 分 振 蕩 混 勻，從 中 吸 取０．１ｍＬ菌液加入１號(hào)ＥＰ管中，振蕩混勻，再從１ 號(hào) ＥＰ管中吸取０．１ｍＬ 菌液加入２號(hào) ＥＰ管中，振 震蕩混勻，依次類推 做１０倍 倍 比 稀 釋，即 分 別 稀 釋 至１×１０－１、１×１０－２、１×１０－３、１×１０－４、１×１０－５、１ ×１０－６、１×１０－７、１×１０－８。分 別 從 １×１０－６、１× １０－７、１×１０－８ ３個(gè) 稀 釋 度 的 ＥＰ 管 中 吸 取０．２ ｍＬ 菌液加入 ＢＨＩ固 體 平 板 上，用涂布棒涂布均勻，每 個(gè)梯度涂３個(gè)平板，倒置于３７ ℃恒溫箱里培養(yǎng)一定 的時(shí)間，記錄每個(gè)平板上的菌落數(shù)，菌 落 個(gè) 數(shù) 在３０ 個(gè)～３００個(gè)的平板計(jì)數(shù)有效。然后取有效計(jì)數(shù)值的 平均數(shù)根據(jù)公式（每毫升中總活菌數(shù)＝同 一 稀 釋 度 ３次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×５）計(jì)算得出所 培養(yǎng)細(xì)菌每毫升中的細(xì)菌數(shù)。

ＬＤ０、ＬＤ１００的 測(cè) 定 根據(jù)文獻(xiàn)方 法，以６只 昆 明 小 鼠 為１組， 分別 腹 腔 注 射 ０．３ ｍＬ 菌 液，含 菌 量 為 ３．３× １０８ ＣＦＵ，記錄３ｄ內(nèi) 小 鼠 的 死 亡 情 況，如 果 小 鼠 全 部存活，劑量增加０．１×１０８ ＣＦＵ，若２只或２只以上 的小鼠死亡，則 劑 量 減 小０．１×１０８ ＣＦＵ，直 至 確 定 一組中只有１只昆明系小鼠 死 亡，則 與 此 劑 量 相 鄰 的低劑量即為 ＬＤ０，按 照 同 樣 的 方 法 給 另 一 組 小 鼠注射含菌量 為２．０×１０９ ＣＦＵ，如 果 全 部 死 亡，則 減 少劑量０．１×１０９ ＣＦＵ，若有２只或２只以上存活，則 增加劑量０．１×１０９ ＣＦＵ，直至確定只有，１只小鼠存 活的劑量，則與此相鄰的最高劑量即為 ＬＤ１００。最終 測(cè) 得 ＬＤ０ 為 ４．９×１０８ ＣＦＵ，ＬＤ１００ 為 １．０５× １０９ ＣＦＵ。

通過菌 落 計(jì) 數(shù)，稀 釋 倍 數(shù) 為１０－７時(shí)，平 板 上 菌 落數(shù)分別為３１、３３、３５，平均為３３個(gè)，根據(jù)公式（每毫 升中總 活 菌 數(shù)＝同一稀釋度三次重復(fù)的菌落平均 數(shù)×稀 釋 倍 數(shù) ×５）計(jì) 算 出 菌 液 濃 度 為 ３．３×１０９ ＣＦＵ／ｍＬ。腹腔注射小鼠后，臨床癥狀表現(xiàn)為精神萎靡、食欲 減退、閉目不睜、喜臥扎堆，可在４８ｈ內(nèi)死亡，７２ｈ后存 活的小鼠逐漸恢復(fù)正常，癥狀消失。對(duì)死亡小鼠剖檢， 發(fā)現(xiàn)腦部水腫，肝臟腫大呈暗黃色，肺臟水腫。腦組織中細(xì)菌的回收鑒定 糞 腸 球 菌 感 染 小鼠后，從腦組織和內(nèi)臟組織中分離得到的細(xì)菌在 ＢＨＩ瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，形態(tài)大小基本一致，為乳 白色的表面 光 滑、整 齊 的 小 菌 落（圖１）。細(xì) 菌 經(jīng) 革 蘭染色，可以觀察到呈單個(gè)、成對(duì)或者短鏈狀排列的 革蘭陽性球菌。綜合糞腸球菌感染小鼠后的死亡情況，腦 組 織 的病理變化結(jié)果，認(rèn)為２／３ＬＤ５０劑量作為建立糞腸 球菌感染小鼠模型的最佳劑量較為合適。

糞腸球菌是一 種 革 蘭 陽 性 球 菌，為 人 和 動(dòng) 物 腸 道內(nèi)的正常 菌 群，通常不引起發(fā)病，當(dāng) 機(jī) 體 的 免 疫力低下時(shí)，糞腸球菌可能會(huì)趁虛而入，變成致病菌 侵入機(jī)體，造 成 感 染 引 發(fā) 疾 病。近 年 來，越 來 越 多的病例報(bào)道表明，腸球菌不僅可以引起尿道感染、 心內(nèi)膜 炎 等，還可以引起敗血癥和腦膜炎，狄 婷 婷報(bào)道，糞腸球菌可致雛鵝或青年鵝發(fā)生昏睡、 持續(xù)性下痢、跛行和癱瘓為主要癥狀，以敗血癥為主 要病理特征的傳染性疾病；劉艷等報(bào)道糞腸球菌 感染一名５歲 女 童 發(fā) 生 化 膿 性 腦 膜 炎；齊 亞 銀 等 報(bào)道羔羊腦膜炎中分離出了糞腸球菌１１株，并在小 鼠的回歸試驗(yàn)中檢測(cè)到分離 菌，腹 腔 注 射 小 鼠 后 均 能對(duì)其造成與發(fā)病羊相同的癥狀，包括精神沉郁、呼 吸急促、有 神 經(jīng) 癥 狀，腦 部 出 血、水 腫 等。據(jù) Ｃｏｑｕｅ Ｔ Ｍ 等報(bào)道，由糞腸球菌引起醫(yī)院內(nèi)的尿路感染 患病率為１６％，僅次于大腸埃希菌；在引起心內(nèi) 膜炎的醫(yī)院院內(nèi)腸球菌感染中，有 ９３％ 為 糞 腸 球 菌；引起敗血癥的腸球菌，８７％為糞腸球菌，但關(guān)于腸球菌引起動(dòng)物腦炎、腦膜炎的病例少有報(bào)道，其 致病機(jī)制尚不明確，因此也給腸球菌的治療和預(yù)防 帶來了困難。