杭白菊 Dendranthema morifolium 又名白菊花， 是享有盛譽的“浙八味”中藥植物之一。浙江省桐鄉 市從明末開始就種植栽培白菊花，至今已有幾百年 的種植歷史，為國家原產地保護的特產，2015 年總 種植面積為3 000 hm2 ，產量為0.91萬t，約占全國總 產量的60%，是當地優勢特色農業產業和農民增收 致富的重要經濟來源（沈瑤等，2017）。隨著杭白菊 產業的發展，因農藥殘留引起的質量安全問題逐漸 暴露出來，已成為制約該產業持續健康發展的關鍵 因子之一。

供試病樣及植物：2015—2016年從浙江省桐鄉 市采集具有典型葉枯病癥狀的現蕾期杭白菊植株用 于病原菌的分離鑒定及后續抗藥性測定；同時于浙 江農林大學東湖校區農作園內種植健康的杭白菊， 用于測定分離病原菌的致病性。 供試藥劑及培養基：98%多菌靈（carbendazim） 原藥，浙江威爾達化工有限公司。馬鈴薯葡萄糖瓊 脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：馬鈴薯200 g、 葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L；燕麥片煎 液瓊脂（oat meal agar，OMA）培養基：燕麥片 30 g、 瓊脂粉18 g，蒸餾水定容至1 L。 試劑及儀器：PCR擴增試劑盒2×Taq PCR Mix、 DNA提取試劑盒、SanPrep柱式PCR產物純化試劑 盒（SK8142），生工生物工程（上海）股份有限公司； 其余試劑均為國產分析純。PHSJ-3F型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；上海精宏MJP-250霉菌培養箱；ABI2720 PCR儀， 美國Bio-Rad公司；Scope. A1型光學顯微鏡，德國卡 爾·蔡司公司。

于 2015—2016 年對浙江省桐鄉市杭白菊生產 基地的葉枯病進行了調查，將采集得到的32份病葉 樣品分別裝于無菌密封袋中帶回實驗室。選取有典 型病斑的葉片，在病健交界處切取5 mm×5 mm大小 的組織塊，在75%乙醇中浸泡消毒5 s后用無菌水連 續漂洗3次，再用1%次氯酸鈉浸泡1 min后用無菌 水浸洗3次，放在滅菌濾紙上晾干后置于PDA平板 上。于 25℃恒溫黑暗培養 3 d 后，挑取菌落邊緣的 菌絲進行純化培養，對分離所得的菌株進行編號并 于PDA斜面保存。

從 1.2.1 中分離保存的菌株中隨機選擇 2 株菌 株，在PDA培養基上進行活化，25℃下黑暗培養7 d 后，用直徑 5 mm 的打孔器在菌落邊緣打取菌餅。 將健康無病且大小一致的現蕾期杭白菊葉片用無菌 水沖洗晾干后，再用無菌針頭刺傷葉片表面后將病 原菌菌餅接種至傷口處，置于 25℃、光照條件為 12 L∶12 D的培養箱中保濕培養3 d，記錄發病情況。 以接種無菌PDA培養基作為對照，每個處理3次重 復。基于柯赫氏法則對接種3 d后發病葉片進行病 原菌的再分離及純化，并與原接種菌株進行比對。

將純化后的菌株分別接種至PDA和OMA平板 上，25℃下黑暗培養 6 d 后，再置于溫度為 25℃、光 照條件為12 L∶12 D的培養箱中培養5 d后，分別觀 察并拍照記錄平板上的菌落生長形態及顏色，并在 顯微鏡下觀察病原菌的產孢結構和分生孢子形態特 征。每株菌株隨機觀察10個視野，每個視野20個分 生孢子，共測量200個分生孢子的大小，以de Gruyter et al（. 1993）和Xu et al（. 2016）的標準作為分類鑒定 的形態學依據。

對32份具有典型病斑的杭白菊葉片樣品進行病原菌分離，共純化獲得 35 株菌株，依據病害“葉 枯”拼音縮寫YK+采樣地點拼音縮寫+序號的原則 對其進行命名，采樣地點包括緣緣菊業基地、李莊、 李家橋、顏井橋、港北、繞城路口、官樓，其拼音縮寫 分別簡寫為YY、LZ、LJQ、YJQ、GB、RC、GL，無地點 編號的菌株均為桐鄉市區采集分離所得。隨機以YK-YJQ-10和YK-LJQ-3作為代表菌株 進行致病性試驗。結果顯示，健康杭白菊葉片在回 接YK-YJQ-10和YK-LJQ-3菌株5 d后，葉片出現深 褐色圓形病斑，呈水漬狀，7 d后病斑繼續擴大，連成 大病斑，葉片枯萎，而對照杭白菊的葉片只 出現褪綠，并無病斑。上述癥狀與采集到的 杭白菊田間自然發病癥狀一致。對病變 組織再次進行病原菌的分離、純化，得到與接種菌株 YK-YJQ-10和YK-LJQ-3相同的病原真菌。滿足柯 赫氏法則，證實分離獲得的菌株確為杭白菊葉枯病 的病原菌。以杭白菊葉枯病病原菌的基因組DNA為模板， 以ITS、LSU和TUB2序列通用引物進行PCR擴增， 分別產生556、1 045和499 bp的目的片段。將3個基 因序列經 MAFF 7.037b 和 GBLOCKS 0.91b 軟件進 行多重比較及保守區域選擇，再利用Sequence Matrix 1.7.8軟件串聯成長度為1 800 bp的基因聯合數 據集，串聯片段中基因順序為：ITS（1~478 bp）、LSU （479~1 469 bp）和 TUB2（1 470~1 800 bp）。串聯片 段序列的系統發育分析結果表明，隨機選擇的YKYJQ-10、YK-YY-1、YK-LZ-9、YK-LZ-10、YK-LJQ-3 和YK-LJQ-4菌株與P. bellidis聚為一簇，結合 病原菌的形態學特征，最終將該病原菌鑒定為莖點 霉屬的P. bellidis。

葉枯病是影響杭白菊產量的主要葉片病害，本研究從浙江省桐鄉市采集得到具有典型葉枯病癥狀 的樣品，通過病害癥狀的系統觀察，病原菌的分離、 純化和致病性測定，結合病原菌的形態學特征和分 子系統發育分析結果，確定引起杭白菊葉枯病的病 原菌是莖點霉屬的 P. bellidis。該病原菌常侵染白 芷、雛菊、荸薺等植物，嚴重影響作物的產量和品質 （Lv et al.，2011；Xu et al.，2016）。而普通菊花上的 黑斑病是由殼針孢屬真菌菊殼針孢菌引起的（楊文 成，1996；張春桃等，2010）。說明杭白菊上病害的病 原菌及發生流行規律很可能與普通菊花存在一定差 異。王呈輝等（2015）曾報道自浙江省磐安縣杭白菊葉枯病病葉中分離到的病原菌為尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporum，病害癥狀主要為變色：葉片先端變 黃，再由局部擴展到整個葉緣，呈褐色至紅褐色的葉 緣病斑；其后病斑逐漸向葉片基部蔓延，直至整個葉 片變為褐色或灰褐色。同年該課題組的馬婉琴等 （2015）報道同樣自磐安縣杭白菊葉枯病病葉中分離 到的病原菌為球毛殼菌Chaetomium globosum，主要癥狀為葉緣變色、卷曲，這也是球毛殼菌能引起植物 病害的首次報道。本研究發現田間杭白菊葉枯病的 主要典型癥狀為褐斑及后期的連片黑斑，與菊花黑 斑病的癥狀類似，但與上述報道的2種真菌引起的 杭白菊葉枯病癥狀不同。表明杭白菊葉片上也可能 存在包括葉枯病在內的幾種病害共同侵染，有待進 一步系統調查和研究。



 

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