材料與儀器

Sigma 3K15 臺(tái) 式 高 速 低 溫 離 心 機(jī)（ 美 國(guó) Sigma 公司）；恒溫?fù)u床（上海精龍躍儀器設(shè)備有 限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物 科技股份有限公司）；PowerPacTMBasic 電泳儀， T100TMThermal Cycler PCR 儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）； Spectra M5 多功能連續(xù)光譜酶標(biāo)儀（美國(guó)分子儀 器公司）；Tanon-4100 全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)（上 海天能科技有限公司）；Biacore T200 生物大分子 互作儀（美國(guó)通用公司）。GK-pCMV6-entry（Origene）、pET28a（本實(shí) 驗(yàn)室 ?80 ℃保存）

實(shí)驗(yàn)方法

將測(cè)序正確的融合蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表 達(dá)菌株 BL21（DE3），平板涂布于含 0.1 mol·L?1 卡那霉素的固體 LB 培養(yǎng)板上，于 37 ℃培養(yǎng)箱中 倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日挑取單菌落搖菌至渾濁，后 按 1 ∶ 100 的比例轉(zhuǎn)接進(jìn)新的 LB 液體培養(yǎng)基并于 37 ℃振搖培養(yǎng)箱中振搖培養(yǎng)（150~170 r·min?1）， 菌液 OD600 至 0.6 左右分別加入不同濃度 IPTG， 孵育不同時(shí)間，低溫收集菌體并超聲破碎取上清， 利用 SDS-PAGE 蛋白電泳分析不同誘導(dǎo)條件下蛋 白的表達(dá)情況以確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。首先是蛋白的預(yù)富集， 將蛋白用 pH 4.5、5.0、5.5 的醋酸鈉分別稀釋到 10 μg·mL?1，通過(guò)預(yù)富集實(shí)驗(yàn)確定 pH 5.0 為最佳 偶聯(lián)條件。芯片用 0.4 mol·L?1 EDC 和 0.1 mol·L?1 NHS 按體積比 1 ∶ 1 混 合 活 化， 用 pH 5.0 的 醋酸鈉將蛋白稀釋至 10 μg·mL?1 進(jìn) 行 偶 聯(lián)， 以 1 mol·L?1 乙醇胺（pH 8.5）封閉活化的芯片表面。 受試化合物用 PBST 緩沖液稀釋到 50、25、12.5、 6.25、3.125、1.562 5 μmol·L?1 后放入儀器。實(shí)驗(yàn) 結(jié)果用自帶數(shù)據(jù)分析軟件 Biacore T200 Evaluation Software 分析。

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